از این پس توس متروکه شد و مشهد جایگاه این شهر به عنوان پایتخت را از آن خود ساخت. بعد از آن، علی‌رغم تلاشی که شاهرخ و شیبک خان ازبک در ۹۱۵ ه‍.ق برای ساخت مجدد شهر انجام دادند، روی آبادانی به خود ندید و به‌تدریج روستاهای کوچکی جایگزین آن همه آوازه و رونق شد.از این زمان به بعد، دیگر عصر حیات تابران به‌سر آمده‌بود و روی توجه تاریخ به‌سوی شهری قرار گرفت، که سده‌ها با نام نوغان و از این زمان به‌بعد با نام مشهد در کنار تابران قرار داشت و جای این شهر را گرفت. در روزگار دوران تیموری در سدهٔ ۹ ه‍. ق، به‌دنبال کوشش‌های شاهرخ تیموری در آبادانی مشهد، به‌همت همسر وی گوهرشادآغا، نخستین مسجد جامع شهر مشهد (مسجد گوهرشاد) با نام وی در سمت قبلهٔ حرم رضوی که — صحن جنوبی را تشکیل می‌دهد — به‌اتمام رسید.از صفویه تا زندیهبا توجه تیموریان به مشهد و به‌ویژه بعد از آن در دورهٔ صفویه با استقرار رسمی مذهب تشیع در ایران و توجه خاص صفویان به مشهد و نیز انتقال آب چشمه گیلاس در دو مرحله (دورهٔ تیموری و دورهٔ صفوی) به مشهد، امید حیات دوبارهٔ تابران به‌کلی از میان رفت. با پیشرفت خاندان صفوی عرصهٔ تازه‌ای از موفقیت برای مشهد آغاز شد.نخستین شاه این خاندان، شاه اسماعیل اول، شیعه را به‌عنوان مذهب رسمی بنیان نهاد و به‌دنبال این رویداد، شهرهای مقدس داخل مرزهای ایران به‌ویژه مشهد و قم، به شاخصه‌ای اصلی در برنامهٔ وی بدل شدند، چنان‌که در مورد جانشینانش نیز همین‌طور بود. زیارت این آرامگاه‌های مقدس رونق قابل‌توجهی را برای این شهرها به ارمغان آورد. در مشهد، بارگاه سلطنتی، فعالیت ساخت‌وساز وسیعی را به‌نمایش گذاشت. در این رابطه به‌ویژه شاه تهماسب اول، جانشین شاه اسماعیل اول و شاه عباس اول از چهره‌های شاخص به‌شمار می‌آیند. سلاطین صفوی که در اعتلای شعائر مذهب شیعه سعی وافر داشتند، خراسان و به‌ویژه مشهد را مورد توجه خاص قرار دادند. برهمین‌اساس، هرات در عهد شاه اسماعیل اول از دارالملک خراسان خارج شد و شهر مشهد جای آن را گرفت.در زمان شاه تهماسب اول، خان‌های شیبانیان چند بار به مشهد حمله و یک بار در سال ۹۳۶ آن را تصرف کرد. سال ۹۹۷ سال فاجعه‌انگیزی برای مشهد بود. عبدالمؤمن شیبانی پس از ۴ ماه محاصره، شهر را مجبور به تسلیم کرد. خیابان‌های شهر مملو از خون شدند و غارت و تاراج سرتاسری در دروازه‌های منطقهٔ مقدس تمامی نداشت. شاه عباس اول که از سال ۹۹۳ تا صعود رسمی تاج و تختش به قزوین در سال ۹۹۵ در مشهد زندگی می‌کرد، تا سال ۱۰۰۶ قادر به بازپس‌گیری مشهد از ازبک‌ها نبود.در دوران پادشاهی شاه عباس اعتبار و رونق شهر مشهد رو به فزونی نهاد. شاهراهی میان اصفهان، مشهد و هرات احداث گردید و کاروانسراها و آب‌انبارهای بزرگ در مسیر آن ساخته شده، حرم رضوی نیز در این عهد توسعه یافت؛ همچنین خیابانی مستقیم از غرب به شرق شهر مشهد در دورهٔ شاه عباس احداث شد که از میان آن نهری جاری بود. از اقدامات دیگر وی در مشهد می‌توان به انتقال آب چشمه گیلاس به مشهد اشاره کرد. شاه عباس، مشهد را به‌طور رسمی «شهر مقدس ایران» قرار داد، تا مردم به زیارت امام هشتم شیعیان بروند و از رنج و مشقت‌های سفر حج و سخت‌گیری‌های حکام ولایات عثمانی دیگر خبری نباشد.در ایرانِ عصر صفوی، فقط ۱۳ شهر دارای بیگلربیگی عظیم‌الشأن بودند، که یکی از آن‌ها مشهد بود. بیگلربیگی مشهد حاکمان تابعی هم داشت که عبارت بودند از حکام سرخس، نیشابور، ترشیز، ابیورد، آزادوار، نسا، سبزوار، اسفراین، حورور ویساکوه، درون، تربت و بزاندوق. همچنین ظاهراً مشهد یکی از معدود شهرهای قلمرو صفویه بوده که در روزگار شاه سلیمان و شاه سلطان حسین در آن سکه ضرب می‌شده است.در سال ۱۱۳۵ و با آغاز حکومت شاه تهماسب دوم، ایل افغانی ابدالی به خراسان حمله کرد. مشهد سقوط کرد؛ اما در سال ۱۱۳۸ ایرانی‌ها موفق شدند پس از محاصرهٔ دوماهه این شهر را باز پس گیرند.خراسان در زمان نادر شاه افشار شامل بخش‌هایی از افغانستان و ماوراءالنهر بوده است که در سایهٔ توسعه‌طلبی‌های نظامی نادر تا مرز هند و ترکستان گسترش یافت. نادر، پایتخت را از اصفهان که یادگار طرفداران صفوی بود به خراسان انتقال داد. او با استفاده از موقعیت ژئوپولتیک خراسان توانست به اهداف سیاسی خود دست یابد. مشهد مرکز سیاسی دولت وی و دژ کلات، حصاری طبیعی در مواقع بحرانی گشت. ارتش او متکی بر نیروی رزمی قومیت‌های گوناگون به‌ویژه عشایر خراسان بود.مشهد در زمان سلطنت نادر به اوج خود رسید. نادر مشهد را به پایتختی برگزید؛ زیرا با توجه به گسترش زیاد متصرفاتش در شرق، مشهد از اصفهان، پایتخت صفویان، دارای مرکزیت بهتری بود. او یکی از بانیان بزرگ حرم علی بن موسی الرضا به‌شمار می‌آید. نادر به‌شکرانهٔ پیروزی بر ملک محمود سیستانی، گلدسته‌ای طلایی در جنوب صحن عتیق (انقلاب کنونی) و شمال‌غربی گنبد بنا کرد.